蒲公英对Ｌｅｗｉｓ肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织干扰素－γ表达的影响

文

罗江秀，钟超，夏承来

深医院药剂科，广东深圳５１８１０６，２．

广州医院药学部，广东广州５１０１５０

摘要

目的研究蒲公英对Ｌｅｗｉｓ肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织干扰素－γ（ＩＦＮ－γ）表达的影响。

方法建立肺癌荷瘤小鼠动物模型，处死小鼠，采用Ｗｅｓｔｅｒｂｌｏｔ和ＲＴ－ＰＣＲ研究不同质量浓度（0，31.3，62.5，，，ｍｇ·ｍｌ－１）的蒲公英以及ｍｇ·ｍｌ－１蒲公英在不同时间（0，12，24，48h）对肺癌组织ＩＦＮ－γ表达的影响。

结果随着蒲公英质量浓度和作用时间的增加，肺癌组织ＩＦＮ－γ表达降低。

结论蒲公英对Ｌｅｗｉｓ肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织ＩＦＮ－γ表达呈现明显的时效－量效关系，提示蒲公英对Ｌｅｗｉｓ肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织的抑制作用和ＩＦＮ－γ有关。

关键词蒲公英；干扰素－γ；Ｌｅｗｉｓ肺癌荷瘤小鼠；肺癌

［中图分类号］Ｒ.5［文献标识码］Ａ

正文

恶性肿瘤严重危害着人类的健康，尤其是肺癌，位列致死病因的第２位，仅次于心血管疾病。世界卫生组织（ＷＨＯ）的调查数据显示，全球新发恶性肿瘤患者男性万，女性万，现患人数超过万，死于这一疾病的万，占总死亡人数的12.6％，预计到年每年新发生的病例数将达万，死亡万，在发展中国家癌症总数将增加73％，发达国家为29％。我国的调查结果显示，－年20年间癌症调整死亡率上升12％，年癌症发病人数万～万，占世界总数的1／5；死亡人数万～万，占世界总数的1／4。在城市居民中，癌症已占死因的首位。近年来的研究表明，蒲公英可以抑制体外培养的肿瘤细胞生长，蒲公英根提取物，蒲公英多糖等均具有一定的防癌、抑癌作用以及抑制肿瘤引起的炎症反应。但是其抗肿瘤的机制并不明确。在本实验中，我们以Ｌｅｗｉｓ肺癌荷瘤小鼠为模型，观察其对肿瘤组织ＩＦＮ－γ表达的影响，为开发本方药新用途提供实验依据。

材料与方法

1

实验药物

药用蒲公英（产地新疆）购自老百姓大药房，由深医院药剂科钟超副主任药师鉴定。本文所选用的药用蒲公英是蒲公英全草经热水提取，减压浓缩后喷雾干燥过80目筛而制成粉末，得率为90％。

2

实验动物

ＳＰＦ级近交ｅｓ７ＢＬ／６纯系小鼠60只，６～８周龄，雄性，体质量16～20ｇ，购于中山大学实验动物部，合格证号：粤实动证字２００９１３９号，饲养于中山大学实验动物学部ＳＰＦ级动物实验室内。实验动物采用随机数字表的方法，随机分成正常对照组、模型对照组、药物处理组。

3

细胞培养

Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞为本研究室保留所得。将Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞置于含10％小牛血清，Ｕ·ｍｌ－１青霉素，Ｕ·ｍｌ－１链霉素的ＤＭＥＭ培养基中，置于含５％ＣＯ２，饱和湿度、３７℃恒温培养箱中培养，每日观察细胞情况，及时更换培养液。

细胞状态和总数达到要求后，台盼蓝拒染法测定活细胞数大于９５％，用无血清培养基调节细胞密度为1×个／ｍｌ，制成细胞悬液备用。

4

试剂

ＤＭＥＭ培养基购自Ｇｉｂｃｏ公司；小牛血清和胰蛋白酶购自杭州四季青生物技术公司；ＭＴＴ（四甲基偶氮唑蓝）、ＤＭＳＯ（二甲基亚砜）和Ｃｏｎ－Ａ购自美国ＡＭＲＥＳＣＯ公司；ａｎｔｉ－ＩＦＮ－γ抗体购自美国ＲＤ公司。

5

Ｌｅｗｉｓ肺癌小鼠模型的建立

无菌条件下，给小鼠体内接种细胞悬液。皮下接种后，待瘤体形成，可以触及皮下直径３～６ｍｍ肿块后，开始给药，腹腔注射，分为荷瘤对照组及不同质量浓度蒲公英提取物处理组，每组10只。荷瘤组为灭菌水，不同质量浓度蒲公英提取物（31.3，62.5，，，ｍｇ·ｍｌ－１），连续14ｄ。每天密切观察小鼠生活状态（精神、进食、毛发色泽、活动、聚集现象）和体质量变化，并用游标卡尺测量肿瘤最长径（ａ）和最短径（ｂ），做详细记录。处死小鼠，分离肿瘤组织备用。正常对照组不接种细胞悬液。

6

ＲＴ－ＰＣＲ

按常规方法提取组织总ＲＮＡ，严格按照逆转录试剂盒说明书将总ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，－20℃备用。根据ＧｅｎＢａｎｋ中公布的基因序列，通过Ｐｒｅｍｉｅｒ5.0软件设计ＰＣＲ特异性引物，聚合酶链反应引物由上海生物工程有限公司合成。扩增条件为：94℃预变性5ｍｉｎ，94℃变性30ｓ，退火30ｓ，72℃45ｓ，共30个循环，72℃延伸７ｍｉｎ。ＰＣＲ产物分析及半定量计算。ＰＣＲ扩增产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳，计算ＴＮＦ－α和ＧＡＰＤＨ条带密度比值（ＴＮＦ－α／ＧＡＰＤＨ），作为各基因相对表达强度。引物序列如下：ＩＦＮ－γ（５１４ｂｐ）ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：５’－ＣＡＣＴＣ－ＧＡＣＣＴＴＡＡＴＣＴＡ－３’；ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：５’－ＣＴＣＴＴ－ＧＡＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＣＡ－３’。ＧＡＰＤＨ（３０２ｂｐ）ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：５’－ＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＡＧ－３’；ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：５’－ＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧ－３’。

7

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ

按常规方法提取组织蛋白，ＢＣＡ法进行蛋白质定量，取30μｇ蛋白质加入１×ＳＤＳ凝胶加样缓冲液中，在℃加热10ｍｉｎ以使蛋白质变性，聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，转ＰＤ－ＶＦ膜，丽春红染色观察转移效果，并确定蛋白质分子质量标准位置。封闭液封闭２ｈ，按1:加入一抗，４℃孵育过夜，ＴＢＳＴ洗３次，按1:的稀释倍数加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育１ｈ，ＴＢＳＴ洗３次，用蛋白质印迹荧光检测试剂盒显示于Ｘ线片。结果用Ｇｅｎｉｕ凝胶图像分析系统对胶片扫描，以对照组的面积灰度值为％与实验组进行比较和半定量分析。

8

统计学分析

所有数据采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件进行分析。计量资料以表示，两组间比较采用ｔ检验，以Ｐ＜0.05为差异有统计学意义。两变量的相关程度采用Ｓｐｅａｒｍａｎ秩相关分析法。

结果

蒲公英提取物对荷瘤小鼠体质量的影响由表１可见，小鼠初始体质量及终末体质量在各组间无明显差异，蒲公英提取物不影响小鼠的体质量增长。

蒲公英提取物对小鼠瘤重及抑瘤率的影响由表２可见，与对照组相比，各剂量组瘤重减轻，抑瘤率增加。

不同质量浓度的蒲公英提取物对荷瘤小鼠肿瘤组织ＩＦＮ－γｍＲＮＡ表达的影响

分别用不同质量浓度（0，31.3，62.5，，，ｍｇ·ｍｌ－１）的蒲公英提取物处理小鼠后，分离瘤体，提取组织总ＲＮＡ，与正常及模型对照组比较，随着蒲公英提取物质量浓度的增加，ＩＦＮ－γ的表达明显下降。说明蒲公英提取物抑制ＩＦＮ－γ的表达，并且呈质量浓度依耐性（图１）。

不同质量浓度的蒲公英提取物对荷瘤小鼠肿瘤组织ＩＦＮ－γ表达的影响

分别用不同质量浓度（0，31.3，62.5，，，ｍｇ·ｍｌ－１）的蒲公英提取物处理小鼠后，分离瘤体，提取组织总蛋白，与正常及模型对照组比较，随着蒲公英提取物质量浓度的增加，ＩＦＮ－γ的表达明显下降。说明蒲公英提取物抑制ＩＦＮ－γ的表达，并且呈质量浓度依耐性（图２）。

５００ｍｇ·ｍｌ－１的蒲公英提取物处理荷瘤小鼠肿瘤组织不同时间后，ＩＦＮ－γ的表达情况

小鼠肿瘤形成后，分别于不同时间（0，12，24，48ｈ）用ｍｇ·ｍｌ－１的蒲公英提取物处理荷瘤小鼠，与对照组比较，随着蒲公英提取物处理时间的延长，ＩＦＮ－γ的表达明显下降。说明蒲公英提取物抑制ＩＦＮ－γ的表达，并且呈时间依耐性（图３）。

讨论

在全球工业化发展的今天，恶性肿瘤的发病率，尤其是肺癌也呈现不断上升的趋势。虽然外科技术和放、化疗技术的迅猛发展，为治愈肿瘤提供了可能，但是外科手术的局限性和化疗药物诸多不良反应，对患者的恢复极其不利。生物治疗肿瘤方案也因价格昂贵，使之发展遭遇到了瓶颈。近年来，中医在防治肿瘤方面的逐步体现了它的优势。由于现在医疗模式的转变，开发特异性强、高效、不良反应小的抗肿瘤药物已经迫在眉睫。与其他的抗肿瘤药物相比，天然植物的化学成分对肿瘤细胞的多靶点效应成为其抗肿瘤作用的重要特点和优势。

有研究表明，蒲公英提取物对人黑色素瘤细胞的生长具有一定的抑制作用。同时，蒲公英的倍半萜内酯糖苷水解产物吉玛酸可诱导人急性早幼粒白血病ＨＬ－６０细胞向单核细胞系／巨噬细胞系分化，提示蒲公英可能在人急性早幼粒白血病治疗方面很有研究前景。并且我们的研究也发现，蒲公英提取物可以抑制小鼠体内肺肿瘤的生长。但是其治疗机制目前仍不清楚。ＩＦＮ－γ是机体防御系统的重要组成部分，其可与多种免疫细胞包括白细胞和血小板、免疫分子相互协同，相互制约，促成了机体最佳的抗肿瘤免疫状态。本实验通过将不同质量浓度的蒲公英提取物处理Ｌｅｗｉｓ荷瘤小鼠肿瘤组织后，发现该组织的ＩＦＮ－γ表达下调，并且呈现质量浓度和时间依赖性，提示该药物抗肿瘤的机制可能和抑制ＩＦＮ－γ表达有关。作为一种无毒且具有多种活性的抗肿瘤成分，蒲公英极具开发潜力，其分子结构可以作为抗肿瘤新药设计的结构基础。但其是否能作为治疗肿瘤的临床药物，还需进一步研究以及在大规模、严密的实验中得到证实。

参考文献略

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