作者

石决明

编辑

兔兔子

来源

实验助手

在现有的实验室条件下，一般采用超低温冻存保藏菌种。从硬件条件的不同来看，比较多见的有-20℃、-40℃、-80℃和液氮（-℃），而随着保藏温度的降低，菌种的新陈代谢速度也随着降低，保藏的时间也随之增加。而针对某一个实验室来讲，硬件条件并不是那么齐备，可能只有一个普通的家用冰箱。那什么条件优化能最大限度的利于菌种保藏呢？从正面讲菌种保藏的文章已经很多，今天我想从反面来介绍一下冻存菌种是怎么死的，希望会有不同的启发。

菌种如果没有冻存，消耗完培养体系中的营养物质，在自身代谢的垃圾包围中逐渐老去，直至死亡。低温冻存延缓了这一过程，但是就是冻存也带给了冻存菌种两次足以致命的考验：

1.菌种在冷冻期间发生收缩，细胞内部水分会形成冰晶破坏细胞结构

2.而后在解冻时菌种细胞又变得肿胀，自由基积累，有些只能短时间存活

针对考验本身来说，就需要在冻存菌种采取一定的行动。首先，冻存操作要慢，有人推荐梯度降温，最后再到超低温。解冻操作要快，迅速达到菌种复苏需要的温度，水浴最佳但是避免剧烈震荡。其次，在冻存培养基中添加防冻剂（让细胞内部不要结冰）和渗透压保持成分（最简单就是生理盐水）。还有就是使用专门的复苏培养基，最好带有抗氧化剂和自由基清除剂，还有适当的营养成分。

甘油冻存法中的甘油就是防冻剂，但是甘油并不是最好的防冻剂。二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide，简称DMSO）是目前最佳的防冻剂，可以取代细胞中的一些水，以防止冰晶形成刺穿细胞，而后在解冻时又防止细胞变得肿胀。一些比较脆弱的细胞，例如原代细胞，的冻存培养基中都含有10%的DMSO。但是DMSO具有一定的毒性，尤其容易渗透皮肤，所以在菌种冻存保藏中才选择了甘油作为替代。在这个角度理解，甘油作为替代防冻剂并不具有类似于DMSO完美的特性，所以在现有甘油保藏1年（-20℃）的水平下已经没有继续开发的必要。

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